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美女人体艺术图片 TNBS携带的结肠炎对成年斑马鱼肠说念神经元亚群的影响｜环特生物斑马鱼筹谋
         发布日期：2024-09-02 09:58    点击次数：60

美女人体艺术图片 TNBS携带的结肠炎对成年斑马鱼肠说念神经元亚群的影响｜环特生物斑马鱼筹谋

中枢节录炎症性肠病 (IBD) 包括胃肠说念(GI)的炎症，其特征是急性炎症讲走漏期。 IBD 的诊疗处分仍然存在问题，因为对其发病机制了解链接对。这项筹谋的要点是2，4，6-(TNBS)携带的结肠炎对成年斑马鱼肠说念神经元亚群变化的影响。这些变化被以为与更正的神经免疫相互作用和 GI 通顺性以及 IBD 发病机制关连。对神经可塑性的新主张将有助于寻找合适的诊疗门径。在麻醉的成年斑马鱼的远端肠 (DI) 中腔内打针 TNBS。创建肠说念炎症反应的组织学本领经过，以树立很好的TNBS 浓度和急性炎症阶段。在总共这个词装载上使用双重免疫记号，分析了炎症对神经元群的影响。基于肠壁增厚、上皮褶皱禁闭、杯状细胞数目减少和嗜酸性粒细胞浸润，咱们的分析标明，携带非致死性炎症的很好的TNBS 浓度（320 mM，溶于 25% 酒精）在携带后 6 小时达到峰值。炎症反应在携带后 3 天还原到基线值。在急性炎症阶段，未不雅察到对氮能神经元分散或比例的影响，而仅胆碱能神经元比例在 DI 中权臣裁减。炎症本领总共这个词肠说念中5-羟色胺能神经元的比例权臣增多。本筹谋神情了 TNBS 携带的成年斑马鱼结肠炎的门径。鉴于急性炎症阶段伴跟着与IBD患者不雅察到的变化格外的神经可塑性，以及斑马鱼的专有和多功能特征，允许该模子与IBD动物模子沿路使用，以解开IBD病理学并测试新的IBD疗法。一、小引炎症性肠病 (IBD) 的特征是胃肠说念(GI)内的慢性免疫激活和炎症，处于急性炎症讲走漏期。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要表型。 连年来，多数关连IBD的常识被揭示出来。可是，IBD的发病机制仍未绝对了解。到当今为止，咱们所知说念的是遗传、环境、微生物和免疫要素之间存在复杂的相互作用。患者会出现痉挛、大便急迫、泻肚、腹痛和体重松开。家喻户晓，IBD或GI炎症会影响GI功能，包括通顺、分泌、收受、肠说念樊篱功能和嗅觉。胃肠功能由自主神经系统松手，包括肠神经系统(ENS)。ENS由存在于胃肠说念壁内的总共神经元构成，并分为两个主要的神经丛，肌间神经丛和粘膜下神经丛。ENS包含一组不同的功能神经元类型，包括嗅觉神经元、中间神经元和通顺神经元，它们在微电路中以突触花样相互调治。先前在动物模子和患者中的筹谋服从标明，炎症会导致结构和结构变化美女人体艺术图片，包括神经变性美女人体艺术图片，在肠神经节和神经丛中，并更正ENS中神经递质、神经肽和受体的抒发。尽管结肠炎的动物模子并不可绝对模拟东说念主的IBD，但通过使用2，4，6-TNBS携带的动物结肠炎，还是获取了关连IBD病理生理学的多数数据。连年来，斑马鱼越来越多地用于揭示东说念主类疾病模式—包括IBD。斑马鱼手脚模式生物具有一些专有的特征，举例，多数的后代、较低的见原老本、绝对测序的基因组、多数可用遗传用具、易于松手的环境以及先天性和适合性免疫反应的存在。还是在幼虫和成年斑马鱼中进行了访佛于小鼠的基于化学的结肠炎携带推行，使用浸泡、口服微灌胃或直肠内给药。随后的免疫反应、遗传要素和环境要素似乎与在哺乳动物小肠结肠炎动物模子中不雅察到的相似。这些筹谋在标明小肠结肠炎的诱发取决于特定的微生物环境，每个推行室皆必须优化我方的TNBS模子。本筹谋侧重于TNBS携带的结肠炎对成年斑马鱼ENS的影响。不同肠说念神经元群内的变化被以为与神经免疫相互作用和胃肠能源的更正关连，以致与IBD的发病机制关连。更好地了解神经可塑性将有助于寻找合适的诊疗门径。斑马鱼的肠说念只须一个由分散的肠神经元构成的非神经节肌间神经丛，莫得黏膜下神经丛。斑马鱼莫得胃，但近端肠(PI)是储存和羼杂食品的局势。接下来是中肠（MI)含有产生粘卵白的杯状细胞和肠细胞，主要用于养分收受。MI的远端部分包含一些假设在肠说念免疫中起作用的特化肠细胞。短远端肠(DI)的结构标明其作用访佛于哺乳动物中的结肠。往时的筹谋标明，成年斑马鱼肠说念中存在不同的神经元亚群，可分为三类：5-羟色胺能、胆碱能和氮能神经元。本筹谋的指标是通过详情很好的剂量和炎症的急性期来优化咱们推行室条款下成东说念主TNBS携带的结肠炎模子，并访谒斑马鱼肠说念中存在的主要肠说念种群的假设神经元变化。二、成年斑马鱼小肠结肠炎的携带雌性斑马鱼（6-8个月）在0.016% MS222（Western Chemical Inc.，Ferndale，WA，USA）中麻醉3分钟，称重、测量并放手在湿纸巾上。腹部被轻轻挤压以增强直肠启齿的可视化。使用外径为0.3 mm的Eppendorf GELoader（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）柔性顶端将妥贴体积（10 μL/g体重）的打针进鱼直肠。为了评估很好的剂量，给鱼打针了融化在25%酒精中的不同浓度的TNBS（Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA）：5 mM、40 mM、80 mM、160 mM、320 mM和640 mM，随后单独放手在透风邃密的寂然罐中，用于个体不雅察和生活分析。对照组包括仅经受25%酒精（10 μL/g体重）的载体组和仅经受操作神气的处理组（对照组）。这部分筹谋中的每个推行组老是包含15条成年斑马鱼，而两个对照组各包含5只动物。6小时后，斑马鱼在0.04%MS222中故去，并分块剖解胃肠说念。将肠在含10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）的4% 多聚甲醛(PFA)中固定过夜，并在PBS中冲洗后，进一步加工以包埋在石蜡中。由MI的后部和DI在HM340E切片机（Microm，Walldorf，Germany）上制成7 μm的一语气切片。先前已讲明成年斑马鱼胃肠说念的后部在基于化学的小肠结肠炎携带中受到影响。瓜代处理切片以进行圭表苏和伊红(H&E)染色，以袒露肠壁的一般形态，或用于阿尔新蓝/PAS反应检测产生粘液的杯状细胞和浸润的嗜酸性粒细胞。使用Olympus DP70相机（Olympus Belgium NV，Aartselaar，Belgium）对每个分析的切片进行拍照。检查了四个不同的参数：肠壁的厚度、上皮褶皱结构、杯状细胞的数目和嗜酸性粒细胞的浸润。使用Image J(NIH， Bethesda， MD)分析图片。在每条鱼的12个切片中测量肠壁的厚度。缱绻平均值（以μm为单元）并凭证其增厚进行细分，鸿沟从0到2（0 =无增厚，≤75 μm；1 =中等增厚，75-95 μm；2 =严重增厚，≥95 μm）。上皮褶皱的结构外不雅凭证三类在每只动物的12个切片中进行评级：0（闲居外不雅）、1（隐微禁闭）或2（严重禁闭：增多的褶皱间距和上皮无缺性的禁闭）。在每条鱼的16个切片上缱绻杯状细胞的数目（1个框架/切片：一个框架的名义积：0.13 mm2）。缱绻平均值并分派一个分数：0 = ≥15个杯状细胞；1 = 10到15个杯状细胞；2 = ≤10个杯状细胞。在归拢帧上，凭证以下评分系统对嗜酸性粒细胞的浸润进行计数：0 =险些莫得任何嗜酸性粒细胞存在；1 =中等浸透；2 =严重浸润，特征为滤过细胞簇。将0至8分的四个分数相加，得出小肠结肠炎总体评分，0至2分示意无炎症，3至5分示意中度炎症，6至8分示意严重炎症。为了详情炎症的急性期，斑马鱼打针了很好的剂量的TNBS，并在3、6和14小时、1、3和7天后故去。如上所述，将肠切出并进行石蜡切片和染色处理。本部分每个推行组和对照组各有5条成年斑马鱼。三、神经元群为了详情神经元群可能发生的变化，在炎症的急性期进行了全肠说念准备。因此，将肠沿肠系膜鸿沟掀开并固定在装有4% PFA PBS的Sylgard-lined培养皿中，室温下放手2小时。固定后，总共这个词支架在PBS中绝对清洗，并进一步处理以获取很好的免疫染色，如前所述。简而言之，在PBS中漂洗后，将总共这个词支架在含有0.05%硫柳汞的PBS中孵育1小时。接下来，在PBS中洗涤后，将它们浸入含有0.1%NaBH-CN的PBS中30分钟并在PBS中冲洗。如前所述，在室温下对总共这个词装配制剂进行双重免疫染色。使用的低级和二级抗体列于表1中。镶嵌总共这个词支架后，使用配备Olympus DP70相机的荧皎皎微镜拍摄图像。为了筹谋小肠结肠炎对肠神经元群的影响，咱们对每个群使用了5只动物，而两个对照组皆包含3只动物。如前所述，肠说念被苟且分红三部分：PI、MI和DI。在每个部分，对10个随即礼聘的区域进行拍照，并如前所述手动计数细胞。为了定量，每个视觉框架(8.2x104 μm2)对免疫反应性细胞体进行计数。总共统计锻练均使用IBM SPSS Statistics 20（IBM，Armonk，NY，USA）进行。服从通过方差分析进行分析，然后在恰其时进行Tukey过后锻练。假设显然性为P<0.05。共聚焦图像是使用PerkinElmer UltraVIEW Vox旋转圆盘共焦系统使用488和 561 nm激光器拍摄的。表1 一抗和二抗列表，以及它们各私用于免疫组织化学的稀释度四、服从1、剂量反应测试了不同的TNBS浓度以找到用于进一步推行的很好的剂量。经受5至160 mM剂量的鱼莫得升天（截止6小时），也莫得发扬出严重的不适。可是，使用更高的TNBS浓度，咱们不雅察到经受320 mM TNBS的鱼有73%存活，而永别经受480 mM和640 mM TNBS的鱼只须55%和25%存活（图1）。打针了480 mM和640 mM TNBS的鱼碰到了剧烈的难受，使用这些剂量的进一步推行被摈斥在筹谋除外。此外，在两个对照组中均未不雅察到高难受评分或升天。对携带后6小时(hpi)收罗的样品的不同组织切片进行评分袒露，浓度为40、80和160 mM时出现中度炎症，而打针320 mM TNBS导致严重炎症（图2）。炎症导致肠壁增厚、上皮结构禁闭、杯状细胞数目减少和嗜酸性粒细胞浸润增多（图3）。对照组和载体组的斑马鱼莫得发扬出任何炎症迹象。意旨的是，在去除肠说念本领故去后，咱们不雅察到对照组和载体组的胆囊呈亮绿色，而在打针40 mM和80 mM TNBS的斑马鱼中变为深绿色，在打针了160 mM和320 mM TNBS的斑马鱼中变为褐色。2、本领反映为了评估炎症的急性期，叠加了相通的推行。用融化在25%酒精中的320 mM TNBS剂量直肠打针鱼，并在携带后3、6和14 hpi、1、3和7天（dpi）正法。组织学评分袒露对TNBS的反应相当快（图 4）。在3 hpi时，不雅察到严重的炎症迹象（分数= 6）。在6 hpi时达到炎症峰值（分数= 8）。在14 hpi时，炎症评分着落（评分= 6）。在1 dpi时，仅不雅察到中度炎症（分数= 4），而在3 dpi时，炎症分数降至基线，并在7 dpi时绝对还原。3、神经元亚群TNBS携带的结肠炎对三种肠说念神经元群的影响在炎症岑岭时进行评估（剂量为320 mM处理6 hpi）。在发炎和非发炎的肠说念中，神经元密度从肠说念的口腔到反面增多，但在比较两种肠说念组织时，莫得不雅察到神经元密度的显然变化（图6A）。氮能神经元的比例分散在炎症和非炎症条款之间莫得袒露任何变化（图5 A，B和6B）（对照：PI 23.6±1.2%；MI 23.3±2.7%；DI 22.3±1.6%；总体 23.07±1.8%//TNBS：PI 24.1±2.1%；MI 22.91±2.1%；DI 24.05±2.8%；总体 23.7±1.9%），而胆碱能和5-羟色胺能的比例袒露变化。对照和TNBS处理的鱼中5-羟色胺能神经元的比例沿着肠说念长度减少（图5 C，D和6C）。比拟之下，TNBS处理的鱼袒露每个肠说念部分的5-羟色胺能神经元比例增多（对照：PI 23.6±2.5%；MI 18.4±3.0%；DI 11.5±1.9%；总体 17.8±3.1%//TNBS：PI 28.6±2.6%；MI 23.2±1.4%；DI 18.4±1.6%；总体 23.4±1.3%）。在对照样本中，胆碱能神经元的总体比例为39.3±3.1%，不同肠说念区域之间莫得任何各异。可是，经TNBS处理的动物在DI中袒表现胆碱能神经元比例裁减（对照：38.48±4.6%//TNBS：21.95±2.5%）（图5 E，F和6D）。五、探求基于关连斑马鱼化学携带小肠结肠炎的推行和提议，咱们在详情了TNBS的很好的剂量(320 mM)和本领(6小时)以携带炎症的急性期后，优化了斑马鱼TNBS携带的小肠结肠炎模子。在炎症的急性期，该模子用于检查小肠结肠炎对ENS的影响。莫得不雅察到对GI壁不同部位的神经元密度或氮能肠神经元群的比例分散的影响。可是，小肠结肠炎导致总共这个词肠说念中5-羟色胺能神经元比例增多，以及肠说念远端胆碱能神经元比例着落。评分系统用于评估炎症进度，如先前在哺乳动物和斑马鱼模子中神情的胃肠说念炎症。咱们对小肠结肠炎急性期杯状细胞数目减少的不雅察服从与筹谋标明，在斑马鱼的遗传和化学小肠结肠炎模子中杯状细胞数目减少以致浮滥，但与之前的TNBS服从不一致筹谋袒露莫得变化，或杯状细胞数目增多。在哺乳动物中，杯状细胞耗竭的数据也不是明确的，有报说念称杯状细胞数目不变或减少。与之前对成年斑马鱼的筹谋一致，咱们在小肠结肠炎的急性期不雅察到肠壁增厚、上皮禁闭和嗜酸性粒细胞浸润。这些风物也在TNBS携带的结肠炎急性期的啮齿动物模子中得到阐述。东说念主体IBD筹谋一样讲解了肠壁增厚和上皮结构禁闭。在东说念主类中，嗜酸性粒细胞的数目格外原位激活在IBD的急性期而非慢性期增多，标明这些粒细胞在不雅察到的病理症状中起关键作用。总之，本筹谋神情了一种化学携带成年斑马鱼DI结肠炎的门径。在急性期，炎症伴跟着神经元含量的抗争衡，与在IBD患者和推行哺乳动物模子中不雅察到的神经元变化格外。除了其多功能特质和可用的遗传用具外，这种斑马鱼模子成为揭示IBD病理学机制和测试新IBD疗法的极好资源。文丨Leen Uyttebroek，Casper Pype， Guy Hubens， Jean-Pierre Timmermans， Luc van Nassauw翻译丨彭逸DOI丨European Journal of Histochemistry 2020; 64:3161  成人视频

 
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